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Stellaris^TM RNA FISH Probes: Detecção, localização e quantificação de mRNA em células.

Stellaris FISH (fluorescence in situ hybridization) é um método de visualização que permite, simultaneamente, a detecção, localização e quantificação de moléculas de mRNA em nível sub-celular em amostras fixadas utilizando um microscópio de fluorescência. O conjunto de sondas FISH Stellaris compreende múltiplos oligonucleotídeos com diferentes sequências cada, com uma marcação fluorescente que coletivamente marca ao longo do transcrito alvo para produzir sinais pontuais.

Protocolo fácil

Passo 1: Preparo da amostra
A amostra é aderida e seccionada em uma lâmina e permeabilizada com EtOH 70%. Variações sutis na preparação de diferentes amostras de organismos distintos são fornedidas nos protocolos anexados. Não necessita de protease.

Passo 2: Hibridização das sondas
Para muitas amostras, a hibridização dura aproximadamente 4 horas a 37ºC em incubador comum.

Passo 3: Lavagem
Após a hibridização, lavar com tampão de lavagem para remoção do excesso de sondas. O tempo total desta etapa é de 1-1.5 hora.

Passo 4: Imagem
A partir desse ponto, a amostra é analisada utilizando um microscópio de  fluorescência comum.

O grande número de sondas no ensaio assegura um alto nível de sensibilidade e especificidade. As redundâncias inerentes ao método de detecção direta minimiza a possibilidade de falsos negativos. O sinal positivo é somente identificado pela localização combinada de sondas múltiplas fluorescentes. Além disso, as sondas se ligam a alvos parcialmente degradados de mRNAs como também em amostras de tecidos FFPE.

Ensaio MULTIPLEX

As sondas estão disponíveis com uma variedade de fluoróforos, incluindo Biosearch Technologies’ CAL Fluor® e Quasar® dyes e pode ser utilizado em ensaios multiplex. A escolha dos dyes em ensaio multiplex é determinada pelos filtros disponíveis para os pesquisadores, mas é possível desenhar um ensaio incluindo marcação nuclear DAPI e conjunto de três sondas marcadas com reporter dyes com o mínimo de sobreposição espectral.

Stellaris™ Probe Designer version 1.0
O cliente tem a possibilidade de desenhar sua sonda pelo Stellaris™ Probe Designer version 1.0 e customizá-la como desejado.  

Catálogo de produtos

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Confira também a webinar sobre “Detecção de  long non-coding RNA pela Sondas  FISH Stellaris”, apresentada pelos pesquisadores da Biosearch Technologies. Clique aqui.

Referências

Batish, M.; Raj, A.; Tyagi, S. Single Molecule Imaging of RNA In Situ.  Methods of Molecular Biology 2011.