ENSAIO DE LAMP COLORIMÉTRICO PARA SARS-COV-2

Código: E2019S | Marca: NEW ENGLAND BIOLABS

Apenas para uso em pesquisa. Não deve ser usado em procedimentos de diagnóstico.

O kit de ensaio LAMP COLORIMÉTRICO PARA SARS-COV-2 utiliza amplificação isotérmica para uso na análise de SARS-CoV-2, o novo coronavírus que causa COVID-19.

O kit LAMP COLORIMÉTRICO PARA SARS-COV-2 Assay utiliza Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) para detectar o ácido nucleico SARS-CoV-2. O kit está disponível apenas para uso em pesquisa e inclui a mistura principal WarmStart Colorimetric LAMP 2X com UDG e uma mistura de primer direcionada às regiões N e E do genoma viral. Os controles são fornecidos para verificar o desempenho do ensaio e incluem um conjunto de primer de controle interno e um modelo de controle positivo. Verificou-se que o cloridrato de guanidina aumenta a velocidade e a sensibilidade da reação RT-LAMP e também está incluído.

Figura 1: Componentes do kit de ensaio LAMP

O kit de ensaio SARS-CoV-2 Rapid Colorimetric LAMP inclui WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix com UDG e uma mistura de primer direcionada às regiões N e E do genoma viral. Os controles são fornecidos para verificar o desempenho do ensaio e incluem um conjunto de primer de controle interno e um modelo de controle positivo. Verificou-se que o cloridrato de guanidina aumenta a velocidade e a sensibilidade da reação RT-LAMP e também está incluído.

Figura 2: Alvos genéticos do kit de ensaio SARS-CoV-2 do genoma e SARS-CoV-2 Rapid Colorimetric LAMP

O kit de ensaio SARS-CoV-2 Rapid Colorimetric LAMP inclui uma mistura de primer duplo que tem como alvo as regiões do gene N e E.

WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix com UDG é uma formulação otimizada de Bst 2.0 WarmStart DNA Polymerase e WarmStart RTx em uma solução de reação especial de baixo tampão contendo um indicador de pH visível para detecção rápida e fácil de reações LAMP e RT-LAMP. A inclusão de dUTP e UDG no master mix reduz a possibilidade de contaminação por transferência entre as reações.


Este sistema fornece uma detecção visual rápida e clara da amplificação com base na produção de prótons e na subsequente queda no pH que ocorre a partir da extensa atividade da DNA polimerase em uma reação LAMP. A diminuição do pH produz uma mudança na cor da solução de rosa para amarelo. O tempo total do protocolo é de 30 minutos e requer apenas um dispositivo de aquecimento simples que pode chegar a 65°C.


Uma detecção positiva da sequência de RNA SARS-CoV-2 seria indicada por uma cor amarela (ocorreu amplificação, prótons liberados, mudança de cor dependente do pH de rosa para amarelo), enquanto um resultado negativo seria indicado por uma cor rosa (não a amplificação ocorreu, nenhum próton foi liberado, nenhuma mudança de cor).

Figura 3: Fluxo de trabalho do kit de ensaio LAMP colorimétrico rápido SARS-CoV-2

No kit de ensaio SARS-CoV-2 Colorimetric LAMP, três reações de controle são executadas com cada amostra de teste. Todas as reações devem ser cor-de-rosa antes da incubação. Usando o protocolo fornecido, uma reação Non-Template Control (NTC) irá conter todos os materiais da amostra de teste (master mix, primers, etc), exceto para o ácido nucleico de entrada de teste em si e serve como uma medida de contaminação da reação e baseada em primer amplificação incorreta. A amostra NTC não deve amplificar e deve permanecer rosa durante todo o experimento. O Controle Positivo (PC) conterá master mix, um plasmídeo que contém o gene N-SARS-CoV-2 (GenBank: MN908947.3) e primers que irão amplificar essa sequência. A amplificação deve ser observada no PC e a amostra deve ficar amarela após a incubação. O Controle Interno (IC) conterá master mix, ácido nucleico de entrada de teste, e iniciadores LAMP para rActin, um gene de manutenção endógeno. Se os reagentes estiverem ativos e as amostras tiverem sido manipuladas de maneira adequada, o IC deve ficar amarelo após a incubação.

Figura 4: O kit de ensaio SARS-CoV-2 oferece suporte a fluxos de trabalho de teste sob demanda e de alto rendimento-2

O kit de ensaio SARS-CoV-2 Colorimetric LAMP pode ser usado para suportar diferentes fluxos de trabalho, cada um dos quais varia com base no número de reações de controle recomendadas. Para baixo rendimento, testes sob demanda, cada teste requer 4 reações: 3 controles (um NTC, PC e um IC) e a amostra de teste. Usar o kit nesta configuração equivaleria a 24 amostras de teste por kit NEB # E2019S (96 reações). Para configurações de alto rendimento, onde placas de amostras são analisadas, apenas 1 NTC e 1 PC precisam ser executados por placa (um IC é recomendado por amostra de teste). Usar o kit nesta configuração equivale a 47 amostras de teste por kit NEB # E2019S (96 reações).

Figura 5: Detecção rápida, simples e baseada em cores de RNA SARS-CoV-2

O ensaio LAMP colorimétrico SARS-CoV-2 foi realizado usando os controles indicados e uma amostra positiva (RNA total humano + RNA sintético SARS-CoV-2) ou amostra negativa (RNA total humano sozinho). São mostrados resultados válidos para o controle não modelo (NTC, rosa), controle positivo (PC, amarelo) e controle interno (IC, amarelo). Na amostra de teste positiva, a amplificação isotérmica do RNA SARS-CoV-2 leva a uma mudança de cor de rosa para amarelo.

Figura 6: Sensibilidade e especificidade robustas

O ensaio LAMP colorimétrico SARS-CoV-2 foi realizado usando amostras positivas (RNA total humano + RNA SARS-CoV-2 sintético em 5.000, 500 ou 50 cópias por reação), amostras negativas (RNA total humano sozinho) ou não modelo (NTCs) conforme indicado. A. Todas as amostras positivas deram um resultado positivo com mudança de cor robusta de rosa para amarelo, incluindo detecção em todas as amostras com uma entrada baixa de 50 cópias por reação (n = 20). B. Nenhuma mudança de cor foi observada para amostras negativas (n = 32). C. Resumo dos resultados de testes análogos conduzidos por 3 usuários em 9 experimentos no total. Com 50 cópias por reação,> 95% (277/288) das reações foram positivas (amarelo). Para amostras negativas,> 99% (358/360) das reações não deram nenhuma mudança de cor (rosa) e 2/360 reações deram uma mudança de cor parcial (laranja, conforme indicado pelo asterisco para os usuários 2 e 3).